DNA - Duplicação

A molécula de DNA é dotada da capacidade de produzir cópias idênticas a ela mesma, sendo essa propriedade denominada duplicação ou replicação. O modelo de Watson e Crick tem implícito um mecanismo para a duplicação do DNA. Durante a replicação (figura abaixo), ocorre separação das cadeias e cada uma delas serve de molde para a formação do seu complemento. Assim sendo, onde na cadeia original existir uma guanina (G), somente uma citosina (C) deverá se encaixar na nova cadeia ou vice-versa e, onde ocorrer uma adenina (A), apenas uma timina (T) se encaixará na nova cadeia ou vice-versa, formando, em condições normais, apenas pares G-C e A-T. Ao fim do processo, formam-se dois DNAs filhos idênticos ao  paterno. Cada uma das moléculas-filhas (ver figura a seguir) possui uma cadeia do DNA original (filamento original) e outra recém-sintetizada (filamento novo). Em face de cada molécula filha conservar metade da molécula mãe, esse processo de duplicação é chamado semiconservativo (em cada nova molécula formada, um filamento é “velho” e o outro é “novo”).

A replicação do DNA depende de um complexo multienzimático (DNA girase outopoisomerase II, primase, DNA ligase, DNA polimerase I, DNA polimerase III, etc.), bem como de nucleotídeos livres e de uma cadeia de DNA que servirá como matriz ou molde, entre outros fatores. O rompimento das diversas pontes de hidrogênio, a fim de separar as cadeias da molécula original, não constitui dificuldade, pois, apesar de serem altamente específicas, são bastante frágeis. A formação e o rompimento dessas pontes independem da DNA polimerase. A ação dessa enzima (figura abaixo) consiste em catalisar a polimerização dos nucleotídeos, formando a ligação fosfodiéster, com liberação de um difosfato.

Durante a replicação do DNA, cada molécula-filha possui apenas uma das cadeias parentais (indicada em preto na figura seguir) emparelhada com uma cadeia nova (indicada em branco na figura abaixo). As duas cadeias parentais originais permanecem intactas, formando-se sempre duas moléculas-filhas a partir da molécula original.

O processo de replicação semiconservativo foi demonstrado experimentalmente, em 1958, por Matthew Meselson e Franklin Stahl. As principais etapas desse trabalho estão esquematizadas na figura a seguir. Eles cultivaram Escherichia coli, durante 14 gerações em um meio de cultura onde a única fonte de nitrogênio(ClNH₄) continha o ¹⁵N, isótopo “pesado” do nitrogênio, em lugar o ¹⁴N, isótopo “leve”, a fim de obter DNA com ambas as cadeias pesadas. Em seguida, transferiram as bactérias para um meio contento ¹⁴N, sob a forma de ClNH₄, como única fonte de nitrogênio, no qual elas foram cultivadas por algumas gerações. Amostras do DNA dessas bactérias foram isoladas antes(parental) e depois da mudança de meio, durante vários intervalos de tempo(primeira geração, segunda geração e terceira geração).

Em função do ¹⁵N ser mais “pesado” que o ¹⁴N, a proporção relativa desses elementos no DNA influencia na sua densidade. As diferentes densidades podem ser evidenciadas através de um gradiente de sedimentação de cloreto de césio, técnica usada por Meselson e Stahl. Quando a amostra de DNA é colocada numa solução concentrada de cloreto de césio e submetida à ultracentrifugação, ela se distribui em bandas, em função da sua densidade e de acordo com o gradiente de densidade formado pela solução de cloreto de césio, como mostra a figura abaixo. Nela, (A) indica a posição antes da centrifugação, com a amostra colocada sobre o gradiente de concentração de cloreto de césio, e (B) indica as diversas posições após a centrifugação, cada uma delas contendo um tipo de molécula de DNA [“pesado”-“pesado” (15-15),“pesado”-“leve” (15-14) e “leve”-“leve” (14-14)].

A figura a seguir mostra as bandas obtidas no trabalho de Meselson e Stahl: (a) DNA “pesado” (ambas as cadeias com ¹⁵N); (b) DNA “leve” (ambas as cadeias com ¹⁴N); (c) bandas resultantes da mistura de DNA com ambas as cadeias “leves” (14-14) e ambas as cadeias “pesadas” (15-15). Ressaltamos que os gradientes representados em (b) e (c) funcionam como controle do experimento, pois, tendo por base as bandas neles indicadas, é possível determinar os tipos de cadeias (“leve” ou “pesada”) presentes nos DNAs das diversas gerações. Assim sendo, percebe-se que em (d), resultado obtido após uma geração no meio ¹⁴N (primeira replicação após a transferência de ¹⁵N para ¹⁴N), há uma única banda com densidade intermediária (14-15), indicando que todas as moléculas de DNA apresentam uma cadeia “pesada” com ¹⁵N (cadeia parental) e uma cadeia “leve” com ¹⁴N (cadeia recém-formada). Em (e), segunda geração, metade das moléculas foi idêntica às da geração anterior (14-15) e a outra metade constituída só de ¹⁴N (banda “leve”). Os resultados indicados em (d) e em (e) são provas inequívocas de que o DNA se replicava semiconservativamente. Em (f), terceira geração, percebe-se a formação de duas bandas, a exemplo do que foi evidenciado em F₂. Nessa geração, das oito moléculas de DNA formadas, apenas 2 (1/4)apresentam densidade intermediária (14-15). Trabalhos posteriores evidenciaram que em eucariotos a replicação do DNA também é do tipo semiconservativo.

A figura abaixo relaciona as posições das bandas em um gradiente de sedimentação de cloreto de césio e os DNAs extraídos durante diferentes gerações [inicial (15-15), primeira (14-15), segunda (14-14 e 14-15) eterceira (14-14 e 14-15)].

A tabela a seguir mostra as porcentagens das diferentes moléculas de DNA ao longo das gerações. Ela representa, resumidamente, os resultados obtidos por Meselson e Sthal, mencionados acima.

	DNA (15N-15N) (“PESADO”)	DNA (14N-15N)(“MÉDIO”)	DNA (14N-14N) (“LEVE”)
Geração inicial/geração parental (antes da transferência)	100%	-	-
Primeira geração (após a transferência de15N para 14N)	-	100%	-
Segunda geração (após a transferência de15N para 14N)	-	50%	50%
Terceira geração (após a transferência de15N para 14N)	-	25%	75%

Em havendo erro durante a replicação, que pode ser “espontâneo” ouprovocado por agentes físicos, químicos ou biológicos, formam-se, em não havendo reparação, DNAs-filhos diferentes do original, gerando alterações conhecidas como mutações gênicas.

No caso do DNA monofilamentar, a duplicação ocorre em duas etapas: ofilamento único (+) orienta a formação da cadeia complementar (-) e esta serve de molde, após separação, para formação de cadeias iguais à original(+).

TRABALHOS DE OKAZAKI

Trabalhos realizados nos anos 1960, por Reiji Okazaki demonstraram que, durante a replicação, uma das novas cadeias do DNA é produzida empedaços curtos, formando os chamados fragmentos de Okazaki, comcerca de 1.000 a 2.000 nucleotídeos e coeficiente de sedimentação em torno de 10S. Dessa forma, a replicação do DNA, além de ser semiconservativa, como mostramos acima, é também“semidescontínua”, havendo uma fita líder ou contínua (leading strand),em que a síntese prossegue na direção 5′ – 3′, mesmo sentido do movimento da forquilha de crescimento, e uma fita descontinuaou “lenta” (lagging strand), na qual a síntese  5′ – 3′ ocorre no sentido aposto à do movimento da forquilha de replicação (forquilha de crescimento). A figura abaixo mostra o esquema atual de replicação “semidescontínua” do DNA. A DNA polimerase III como todas as demais DNAs polimerases já caracterizadas até o momento, só adicionam nucleotídeos no sentido 5′ - 3′. Como as duas cadeias do DNA são antiparalelas (ver modelo de Watson e Crick) e a replicação de ambas é simultânea, uma delas (fita “lenta” ou “atrasada”) tem obrigatoriamente de ser feita na direção da origem. Ao contrário da fita “rápida”, ela tem que ser reiniciada várias vezes e, desse modo, sua síntese é descontínua. Outro ponto importante é que as cadeias são começadas a partir de um iniciador (primer) que é umoligorribonucleotídeo (RNA primer, especificamente), contendo cerca de 10 a 12 ribonucleotídeos, sintetizado por uma enzima denominadaprimase, que é uma RNA polimerase. Isso se deve ao fato da DNA polimerase ser incapaz de iniciar a polimerização de nucleotídeos, capacidade que a RNA polimerase possui. A partir desse RNA inicial, segue-se a inserção dos desoxirribonucleotídeos, constituintes do DNA. O referido primer é posteriormente removido pela DNA polimerase I que também completa a “falha” com os desoxirribonucleotídeos correspondentes, cabendo à DNA ligase fazer ajunção das extremidades 3′OH e 5′P da cadeia. Devemos ressaltar que, em função de haver uma grande probabilidade de erros na inserção dos primeiros nucleotídeos, a formação do RNA primer é importante para a manutenção da fidelidade do DNA. A remoção dos primeiros nucleotídeos inseridos elimina uma provável mutação que possa ter ocorrido.

Lembramos (figura a seguir) que a fita líder (“adiantada”) prossegue continuamente a partir de um único primer de RNA. Na fita “lenta”(descontínua), entretanto, cada fragmento de Okazaki é sintetizado a partir de um primer. Dessa forma, na fita descontínua o número primer é igual ao número de fragmentos de Okazaki formados. Como se pode constatar, aduplicação do DNA é bidirecional. Ressaltamos que, durante a replicação, aproteína específica de filamento único (mostrada na figura acima) também conhecida como proteína de ligação de fita simples, liga-se ao DNA monofilamentar impedindo que os dois filamentos se reassociem imediatamente.

A tabela abaixo mostra, resumidamente, a ação das principais enzimas relacionadas com a duplicação do DNA.

ENZIMA	AÇÃO
DNA polimerase I	Remove os RNAs iniciadores dos fragmentos de Okazaki (atividade exonucleolítica) e preenche os espaços na fita complementar.
DNA polimerase III	Catalisa o acréscimo de desoxirribonucleotídeos na forquilha de crescimento.
Primase(RNA polimerase)	Catalisa a formação dos RNAs iniciadores para a síntese de DNA.
DNA ligase	Catalisa a união dos fragmentos adjacentes de Okazaki.
Helicase	Movimenta-se ao longo da dupla hélice de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para desenrolar as duas fitas.
Topoisomerase I	Corta uma fita do DNA, rotaciona essa fita sobre a outra e rejunta as extremidades, evitando o emaranhamento do DNA durante a replicação.
Girase (topoisomerasetipo II)	Corta e rejunta ambas as fitas, evitando o emaranhamento do DNA durante a replicação.